一、技術(shù)原理與核心設(shè)計(jì)

1. ?多用途模塊化設(shè)計(jì)?

   • ?三位一體功能?：通過單次構(gòu)建實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)KO、條件性KO（CKO）和報(bào)告基因過表達(dá)三種模式切換。
   • ?核心元件?：
     • ?基因陷阱模塊?：5'UTR插入SA-βgeo（剪接受體-β半乳糖苷酶融合基因），實(shí)現(xiàn)組成型基因沉默。
     • ?條件性模塊?：關(guān)鍵外顯子（如第2-4號）兩側(cè)插入loxP位點(diǎn)，支持Cre介導(dǎo)的組織特異性敲除。
     • ?篩選標(biāo)記?：FRT-flanked NeoR（新霉素抗性基因），用于ES細(xì)胞陽性克隆篩選，后續(xù)可通過Flp重組酶切除。

2. ?技術(shù)優(yōu)勢?

   • ?靈活性?：同一模型可滿足不同研究階段需求，避免重復(fù)構(gòu)建。
   • ?效率提升?：整合報(bào)告基因（如LacZ或熒光蛋白）便于表達(dá)譜分析。

二、構(gòu)建流程（以ES細(xì)胞同源重組為例）

1. ?靶向載體設(shè)計(jì)?

   • 同源臂長度：5'和3'臂各1.5-3 kb，確保重組效率。
   • 關(guān)鍵外顯子選擇：避開頭個(gè)外顯子（防止啟動子破壞），通常靶向第2-4號外顯子。

2. ?ES細(xì)胞編輯與驗(yàn)證?

   • ?電轉(zhuǎn)與篩選?：線性化載體電轉(zhuǎn)至JM8A3.N1等ES細(xì)胞，G418篩選7-10天。
   • ?克隆鑒定?：
     • 5'端PCR（同源臂外側(cè)引物+βgeo內(nèi)引物）。
     • Southern blot確認(rèn)單拷貝整合23。

3. ?小鼠繁育與模型切換?

   • ?F1代?：嵌合體小鼠與野生型交配，獲得SA-βgeo-loxP-Exon2-loxP-NeoR+后代。
   • ?NeoR切除?：F1代與Flp deleter小鼠交配，生成僅含SA-βgeo和loxP的"clean" KO-first小鼠。
   • ?條件性敲除?：與組織特異性Cre小鼠雜交，實(shí)現(xiàn)靶向基因敲除36。

三、應(yīng)用場景與典型案例

1. ?基因功能多維度研究?

   • ?傳統(tǒng)KO模式?：通過SA-βgeo阻斷基因轉(zhuǎn)錄，研究全身性功能缺失表型。
   • ?條件性KO模式?：如肝臟特異性敲除代謝相關(guān)基因研究非酒精性脂肪肝。

2. ?報(bào)告基因應(yīng)用?

   • β-galactosidase（βgeo）表達(dá)可追蹤內(nèi)源基因表達(dá)譜。

3. ?胚胎致死基因研究?

   • 避免傳統(tǒng)KO導(dǎo)致的發(fā)育缺陷，通過時(shí)空特異性敲除解析基因在成體中的作用。

四、技術(shù)挑戰(zhàn)與優(yōu)化方向

1. ?脫靶風(fēng)險(xiǎn)控制?

   • CRISPR-Cas9需優(yōu)化gRNA設(shè)計(jì)，ES打靶需嚴(yán)格驗(yàn)證同源重組效率。

2. ?繁育周期優(yōu)化?

   • 傳統(tǒng)ES打靶需7-12個(gè)月，CRISPR輔助構(gòu)建可縮短至6-9個(gè)月。

3. ?倫理合規(guī)性?

   • 遵循"3R原則"，優(yōu)先使用現(xiàn)有資源庫模型（如南模生物6000+成品小鼠）