《Nature communications》是自然出版集團（Nature Publishing Group）旗下的一本開放獲?。∣pen Access）綜合性學(xué)術(shù)期刊，
于2010年創(chuàng)刊。
出版周期：Bimonthly；
影響因子：14.7；
ISSN：2041-1723；
發(fā)文量：7910篇/年；
審稿速度：平均1.0個月；
版面費：USD 6790.00；
一、研究背景與目標(biāo)
B7H3（CD276）是一種高度N-糖基化的膜蛋白，在多種實體瘤中高表達，通過抑制T細胞功能促進腫瘤免疫逃逸，但具體糖基化位點對其
功能的調(diào)控機制尚不明確。N-糖基化影響蛋白折疊、運輸和降解。異常糖基化可導(dǎo)致蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）中積累并通過ER相關(guān)降解（ERAD）
途徑**。該研究聚焦于免疫檢查點分子B7H3的N -糖基化修飾，揭示了其在腫瘤免疫逃逸中的關(guān)鍵作用，并開發(fā)了靶向糖基化B7H3的
單克隆抗體，為腫瘤免疫**提供了新策略。
二、關(guān)鍵技術(shù)總結(jié)
1、通過CRISPR-Cas9、sgRNA技術(shù)構(gòu)建敲除細胞系，研究糖基化位點功能；
2、采用WB、IP、IF、FCM的方法檢測B7H3表達、定位、泛素化及與其他蛋白互作；
3、構(gòu)建荷瘤小鼠和人源化模型驗證B7H3糖基化對腫瘤生長的影響及抗體**效果；
4、單克隆抗體篩選技術(shù)及SPR篩選特異性抗體并分析其結(jié)合特性；
5、TCGA數(shù)據(jù)分析驗證B7H3表達與臨床預(yù)后及免疫浸潤的相關(guān)性；
三、主要研究結(jié)果
1、B7H3的N-糖基化位點對其細胞表面定位和蛋白穩(wěn)定性的影響
圖1、B7H3前體的細胞表面定位和穩(wěn)定性維持依賴于其N91/N309和N104/N322位點的N-糖基化修飾
2、B7H3糖基化位點N91/309和N104/322突變對其亞細胞定位及ER-Golgi轉(zhuǎn)運的影響
圖2、B7H3在N91/309和N104/322位點的糖基化缺失會導(dǎo)致其無法正常從ER轉(zhuǎn)運至高爾基體，進而在ER中積累并被降解。
3、糖基化修飾通過調(diào)控ERAD途徑影響B7H3穩(wěn)定性的分子機制
隨后，通過免疫沉淀-質(zhì)譜（IP-MS）、蛋白質(zhì)降解實驗及泛素化分析，在穩(wěn)定表達野生型（WT）或糖基化突變型B7H3的細胞中，
研究糖基化缺失對ERAD途徑的激活作用。
圖3、糖基化修飾通過調(diào)控ERAD途徑影響B7H3穩(wěn)定性的分子機制
IP-MS分析結(jié)果表明，N91/104/309/322Q和8NQ突變體的B7H3與ERAD途徑組分（如 p97、HRD1、SEL1L）的結(jié)合顯著增加，
通路富集分析顯示ERAD相關(guān)通路顯著激活；使用 p97 ATP酶抑制劑（NMS-873、CB-5083）或蛋白酶體抑制劑（MG132）處理
細胞后，N91/104/309/322Q和8NQ突變體的B7H3降解被顯著抑制，表明p97介導(dǎo)的ERAD途徑參與其降解；泛素化水平檢測發(fā)現(xiàn)
N91/104/309/322Q和8NQ突變體的B7H3總泛素化及K48-linked泛素化水平顯著升高，而p97抑制劑處理進一步增強該泛素化；
免疫共沉淀顯示 N91/104/309/322Q突變體的B7H3與ERAD核心組件HRD1、SEL1L的結(jié)合顯著增強，敲低HRD1或SEL1L后，
N91/104/309/322Q突變體的B7H3降解速率顯著降低，K48-linked 泛素化水平也隨之下降，證實HRD1和SEL1L在ERAD中的關(guān)鍵作用。
這些結(jié)果表明B7H3 在N91/309和N104/322位點的糖基化缺失會使其被ERAD途徑識別，通過HRD1-SEL1L 復(fù)合物介導(dǎo)K48-linked泛素化，
進而被p97依賴的蛋白酶體降解。
4、B7H3抑制T細胞增殖和活化依賴于N91/309和N104/322位點的糖基化
圖4、B7H3在N91/309和N104/322位點的糖基化對其體外抑制T細胞功能的調(diào)控作用
5、B7H3在N91和N104位點的糖基化對體內(nèi)抗腫瘤T細胞應(yīng)答的調(diào)控作用
圖5、B7H3在N91和N104位點的糖基化通過抑制CD8+ T細胞活化和浸潤，促進腫瘤免疫逃逸。
6、糖基化特異性B7H3抗體Ab-82的篩選和鑒定
通過單B細胞抗體生成技術(shù)篩選特異性識別糖基化B7H3的單克隆抗體，并通過流式細胞術(shù)、表面等離子體共振（SPR）及免疫印跡等方法
驗證其結(jié)合特性。用重組人4Ig-B7H3-His 融合蛋白免疫日本白兔，提取脾細胞通過單B細胞技術(shù)生成抗體，經(jīng)ELISA和流式細胞術(shù)篩選出
優(yōu)先結(jié)合N91/309/N104/322糖基化B7H3的Ab-82；驗證發(fā)現(xiàn)，Ab-82可識別野生型（WT）和N91/309/N104/322糖基化B7H3，但不結(jié)合
N91/309/N104/322Q突變體或去糖基化B7H3（PNGase F處理后）。
圖6、糖基化特異性B7H3抗體Ab-82的生成過程及其結(jié)合特異性驗證
SPR分析顯示Ab-82與B7H3的解離常數(shù)（KD）為3.0×10?9M，表明高親和力結(jié)合，與商業(yè)抗B7H3抗體（eBioscience）相比，Ab-82對
N91/309/N104/322Q突變體的結(jié)合不受HRD1敲除（ERAD抑制）的影響，證實其依賴糖基化的特異性。免疫沉淀（IP）分析發(fā)現(xiàn)，
Ab-82優(yōu)先結(jié)合WT和N91/309/N104/322糖基化 B7H3，不結(jié)合8NQ或N91/309/N104/322Q突變體，而商業(yè)抗體可結(jié)合所有形式的B7H3；
Dot blot 驗證表明，去糖基化的B7H3蛋白無法被Ab-82識別，進一步證明其依賴糖基化位點的結(jié)合特性。
7、Ab-82的體內(nèi)抗腫瘤機制及人源化抗體的療效及作用機制研究
在4T1-hB7H3 荷瘤小鼠中，Ab-82（0.25–1 mg/kg）顯著抑制腫瘤生長，且1 mg/kg組腫瘤重量較對照組降低約70%，無明顯肝腎功能毒性；
而在huPBMC-NOG小鼠中，5 mg/kg Hu-Ab-82使A549腫瘤體積減少約60%，且腫瘤內(nèi)人類CD8+ T細胞和GZMB+細胞比例顯著增加。
Ab-82處理后，MDA-MB-231和A549細胞的膜表面B7H3表達量呈劑量依賴性下降，而商業(yè)抗B7H3抗體不影響膜B7H3水平。pHrodo Red標(biāo)記的
Ab-82在37℃下可進入腫瘤細胞，且內(nèi)吞量隨時間增加（24 h達峰值），而低溫（4℃）或內(nèi)吞抑制劑（primaquine）可阻斷該過程；此外，
Ab-82優(yōu)先介導(dǎo)WT和N91/309/N104/322糖基化B7H3的內(nèi)吞，對8NQ或 N91/309/N104/322Q 突變體的內(nèi)吞作用顯著減弱。同時，
Ab-82處理增加4T1腫瘤中 CD4+/CD8+ T細胞比例，且GZMB+細胞（細胞毒性T細胞標(biāo)志物）數(shù)量顯著增多；免疫組化顯示，Ab-82處理組
腫瘤組織的B7H3表達量較對照組降低約50%，伴隨T細胞介導(dǎo)的殺傷增強。這表明Ab-82通過特異性結(jié)合糖基化B7H3，誘導(dǎo)其內(nèi)化與降解，
解除B7H3對T細胞的抑制，從而激活抗腫瘤免疫應(yīng)答。人源化抗體Hu-Ab-82在人源化模型中驗證了療效與**性，為靶向糖基化B7H3的
免疫**提供了臨床轉(zhuǎn)化依據(jù)。
四、全文結(jié)論
本研究證實B7H3的N91/309和N104/322 糖基化位點是其發(fā)揮免疫抑制功能的關(guān)鍵，靶向該位點的抗體Ab-82可通過誘導(dǎo)B7H3內(nèi)化和降解，
激活抗腫瘤T細胞應(yīng)答。這一發(fā)現(xiàn)為開發(fā)基于糖基化位點的免疫**藥物提供了新思路，有望成為腫瘤免疫**的新靶點。
參考文獻：Huang Y, Zhong WQ, Yang XY, Shan JL, Zhou L, Li ZL, Guo YQ, Zhang KM, Du T, Zhang HL, Hu BX, Chen YH, Yang D, Feng GK,
Tang J, Zhu XF, Deng R. Targeting site-specific N-glycosylated B7H3 induces potent antitumor immunity. Nat Commun. 2025 Apr 14;16(1):3546.
doi: 10.1038/s41467-025-58740-3. PMID: 40229277; PMCID: PMC11997214.
